I vincitori

Edizione 2017-2018

Il tumore del polmone nelle donne e le nuove sfide della medicina di genere: identificazione di marcatori biomolecolari per un approccio terapeutico personalizzato sesso-specifico

Responsabile del progetto:

Tiziana Vavalà
Specialista in oncologia

-
ASL CN1
ASL CN1&Università di Torino

 

Il progetto

Durata prevista: in corso
Sintesi del progetto di ricerca
Il progetto di ricerca ha il fine di giungere ad un miglior livello di conoscenza dell'assetto biomolecolare, evidenziando possibili differenze tra i due sessi con l'utilizzo di tecniche sofisticate quali quelle di Next-generation sequencing, in pazienti affetti da tumore al polmone. Inoltre, sulla scorta dei risultati di uno studio condotto dall’Università di Torino, ci si è posti il proposito di eseguire la determinazione del recettore estrogenico beta (ERβ) su tutti campioni bioptici di tessuto neoplastico appartenenti ai pazienti inclusi nello studio, analogamente alla valutazione di mutazione geniche associate alla risposta ai trattamenti oncologici, già note. Questo tipo di analisi ha l’obiettivo di descrivere un quadro completo del profilo estrogenico e del pattern mutazionale dei pazienti presi in esame da correlare con le caratteristiche clinico - patologiche. A questi, sulla base dei nuovi dati pubblicati in letteratura, si è aggiunta la valutazione prospettica di PD-L1 (programmed death Ligand-1) con l’obiettivo di individuare eventuali differenze di genere nell’approccio e/o nella risposta ad un eventuale trattamento immunoterapico. Per le pazienti è stato prodotto un questionario per la raccolta dettagliata dell'anamnesi ginecologica con particolare attenzione alla familiarità per patologie oncologiche, all'età del menarca, età al primo figlio, allo stato pre/post menopausa al momento della diagnosi, all'assunzione di terapie ormonali sostitutive e contraccettivi orali. Per tutti i pazienti è stata inoltre proposta una dettagliata anamnesi delle patologie autoimmuni. Tra gli scopi più importanti dello studio è la valutazione delle associazioni tra le mutazioni identificate e le eventuali differenze tra fumatrici e non-fumatrici. Con tali analisi sarà possibile categorizzare, in termini prospettici, la popolazione di pazienti individuando caratteristiche molecolari utili a selezionare trattamenti personalizzati con l'intento di proporre studi clinici di farmacogenomica multicentrici sesso-specifici. In conclusione, differenze di genere saranno descritte, per quanto riguarda i tumori polmonari, in termini di dati epidemiologici, caratteristiche biomolecolari e cliniche della malattia; al momento non esiste un diverso approccio alla patologia in ambito diagnostico o terapeutico per uomo e donna. Il progetto proposto mira ad accrescere le conoscenze su questo argomento contribuendo ad affinare il concetto di caratterizzazione della malattia in relazione alle differenze di genere e successiva “personalizzazione” del trattamento.

Premessa/Introduzione

Il tumore polmonare è stato a lungo considerato una patologia a retaggio maschile, ma i dati epidemiologici evidenziano oggi una crescita esponenziale della sua incidenza e mortalità nelle donne: a partire dagli anni ’80, il divario tra i due sessi si è ridotto, principalmente a causa del drammatico aumento del consumo di tabacco anche nella popolazione femminile. Il tumore del polmone nelle donne è molto raro prima dei 50 anni (2% di tutte le diagnosi di tumore), è la quarta neoplasia fra i 50 e i 69 anni (7%) e la terza al di sopra dei 70 anni (7%). Ad oggi, al netto degli effetti legati all’invecchiamento della popolazione, si registra una marcata diminuzione di incidenza negli uomini (in relazione ad una altrettanto marcata riduzione dell’abitudine al fumo), pari a -1,7%/anno negli ultimi anni. A questa tendenza corrisponde tuttavia un aumento dei nuovi casi tra le donne (+3,1%/anno dal 2003 al 2017). In merito alla mortalità, nelle donne è la seconda causa di morte per neoplasia nelle fasce di età 0-49 e 50-69 anni (rispettivamente il 9% e il 14%) e la terza causa nelle ultrasettantenni (10%). Ogni anno, tra le donne, si registrano più decessi a causa del tumore al polmone che per tumore mammario, ovarico e uterino considerati tutti insieme. Numerosi dati depongono per una maggiore suscettibilità delle donne nei confronti dei carcinogeni presenti nel fumo di sigaretta rispetto agli uomini. L’abitudine tabagica è responsabile dell’induzione dell’espressione del gene del citocromo P-4501A1 (CYP1A1): il livello di espressione genica di CYP1A1 ed il numero di addotti di DNA sono significativamente maggiori nel tessuto polmonare di soggetti fumatori rispetto a quello di soggetti non fumatori e le donne fumatrici sembrano avere livelli di espressione genica di CYP1A1 ed addotti di DNA di gran lungapiù elevati rispetto agli uomini. Rispetto agli uomini, le donne hanno in genere un’età inferiore alla diagnosi e sono caratterizzate da un migliore andamento della malattia, in ogni stadio e indipendentemente dal tipo di approccio terapeutico. Anche la distribuzione degli istotipi differisce in modo significativo tra i due sessi essendo nelle donne l’adenocarcinoma la forma tumorale più comune. Tra gli elementi alla base di tali diversità potrebbero esservi anche influenze ormonali. Il recettore estrogenico classico (ERα) è presente nella maggior parte dei carcinomi polmonari, con una maggiore espressione nelle donne rispetto agli uomini e nei pazienti affetti da adenocarcinoma polmonare rispetto a quelli affetti da tumori di altro tipo istologico. L’espressione del recettore ERα è maggiore a livello endometriale, ovarico e mammario, mentre l’espressione del recettore ERβ prevale sulle cellule della granulosa, su quelle endoteliali, a livello dell’ovaio e del polmone e regola lo sviluppo polmonare in modelli murini. Taioli e coll. hanno evidenziato che la stimolazione estrogenica esogena ed endogena è direttamente correlata allo sviluppo di adenocarcinoma polmonare ed un’analoga correlazione é stata descritta anche tra l’impiego di terapia ormonale sostitutiva (HTR) ed il fumo di sigaretta. La combinazione di HTR e fumo di sigaretta comporta un maggior rischio di sviluppare carcinoma polmonare nei soggetti di sesso femminile con un odds ratio di 1,7 nelle donne non fumatrici e di 32,4 in quelle fumatrici. Sono stati inoltre condotti studi sul potenziale ruolo della terapia antiestrogenica nello sviluppo di neoplasie polmonare: in più di 15.000 donne non è stata dimostrata alcuna associazione tra il trattamento con tamoxifene ed il rischio di sviluppare un secondo tumore a livello polmonare. Per quanto riguarda l’associazione tra il numero di gravidanze e lo sviluppo di neoplasie polmonari, vari studi condotti hanno dato risultati contrastanti: uno studio Cinese riporta una significativa riduzione del rischio di malattia (in particolare adenocarcinoma), nelle donne con anamnesi positiva per 3 o più gravidanze con parto a termine e nato vivo, mentre altri due studi hanno indicato un aumento del rischio proporzionale al numero delle gravidanze stesse. Altri studi, infine, non evidenziano alcuna correlazione. Pochi studi clinici hanno valutato l’associazione tra l’uso dei contraccettivi orali e lo sviluppo di tumore polmonare, con risultati peraltro inconsistenti. Si pensa che gli estrogeni possano giocare un ruolo nella genesi dei tumori del polmone attraverso la proliferazione cellulare indotta dall'interazione con i ligandi del recettore dell'estrogeno (ER) e il cross-talk tra i recettori per gli estrogeni e recettori di fattori di crescita (quali i recettori del fattore di crescita insulinico ed epidermico). Vi sono infine evidenze sull'espressione del recettore progestinico nei tumori del polmone non a piccole cellule: estrogeni e progesterone lavorano sinergicamente in vitro nella promozione della secrezione del fattore di crescita vascolare, nell’aumentare l'angiogenesi associata al tumore e le cellule tumorali staminali/progenitrici. Sebbene il fumo di sigaretta rappresenti la principale causa di tumore polmonare, il 10-15% circa delle neoplasie polmonari viene diagnosticato in soggetti non fumatori e, tra questi, tre volte più frequentemente nelle donne rispetto agli uomini. Sono state dunque indagate specifiche alterazioni geniche con evidenza di differenze rilevanti tra uomini e donne: quella più conosciuta è la mutazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFr), che si riscontra con più frequenza in presenza di fattori clinici quali la diagnosi di adenocarcinoma, il sesso femminile, la razza asiatica e la condizione di non fumatore. Inoltre, il recente sviluppo nella comprensione della biologia dei tumori polmonari ha portato ad approfondire ulteriormente la ricerca dei biomarcatori molecolari, anche in ambito immunologico, con il doppio obiettivo di identificare fattori prognostici e predittivi di risposta. La tecnologia di Next-generation sequencing (anche conosciuta come sequenziamento parallelo massivo) permette di catalogare le mutazioni, le aberrazioni cromosomiche ed i riarrangiamenti somatici che avvengono nell’intero genoma tumorale in poco tempo ed a una risoluzione inimmaginabile solo 10 anni fa.

Obiettivi specifici 

L’obiettivo di questo progetto di ricerca è giungere ad un miglior livello di conoscenza dell'assetto biomolecolare tra i due sessi caratterizzando dal punto di vista genomico, con tecniche di Next-generation sequencing, e dal punto di vista immunologico, pazienti affette da neoplasia polmonare e la controparte maschile al fine di evidenziare eventuali differenze di genere; verrà eseguita inoltre la determinazione del recettore estrogenico beta (ERβ) su tutti campioni bioptici di tessuto neoplastico appartenente ai pazienti inclusi nello studio.

Descrizione della metodologia (ed eventuali materiali)

Lo studio è articolato secondo le seguenti modalità:
1. Analisi mutazionale con tecniche di Next-generation sequencing.
-Raccogliere una casistica di almeno 50 campioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina, appartenenti a pazienti donne affette da carcinoma polmonare metastatico e 50 campioni di tessuto tumorale fissato in formalina e incluso in paraffina, appartenenti a pazienti uomini affetti da carcinoma polmonare metastatico. Tutti i casi saranno anonimizzati da uno staff specializzato esterno a questo studio, prima della stesura del progetto. Su tali campioni si intende:a) Creare per ciascun paziente una library genomica che ci permetta di valutare le mutazioni presenti in 46 oncogeni conosciuti. b)Valutare il profilo mutazionale ottenuto rispettivamente nel campione maschile e nel campione femminile. c) Confrontare il profilo mutazionale ottenuto nel campione femminile contro le caratteristiche clinico patologiche delle pazienti, con particolare attenzione per lo stato di fumatrice, l'anamnesi ginecologica e la familiarità per patologie oncologiche nonché l’anamnesi di patologie autoimmuni in entrambi i sessi. d) Validare le mutazioni identificate dal sequenziatore vs tecniche classiche di biologia molecolare e, a seconda della mutazione, valutare la possibilità di utilizzare farmaci specifici se presenti. e) Per i pazienti positivi alle mutazioni, valutare la presenza delle stesse nel tessuto peritumorale o nei globuli bianchi al fine di stabilire se la mutazione era presente nel tessuto precancerogeno o è stata selezionata dal tumore stesso.
2. Analisi trascrizionale/IHC. Per tutti i pazienti sarà valutata l'espressione del recettore estrogenico beta (ERβ) sul materiale bioptico. Saranno inoltre valutati con la tecnologia della qPCR l’abbondanza dei trascritti dei geni TYMS, RRM1, ERCC1 come da procedure ottimizzate in laboratorio e la presenza di marcatori proteici specifici del carcinoma polmonare mediante IHC.
Metodiche applicate
- Next-generation sequencing: La metodica sarà eseguita utilizzando il kit Ion AmpliSeq™ Cancer Panel (lifeTechnology) per la creazione della library di mutazione di 46 oncogeni conosciuti ed il sequenziatore di nuova generazione IonTORRENT Personal Genome Machine (lifeTechnology) per la generazione delle sequenze. Le sequenze verranno analizzate sul Torrent Server IT (lifeTechnology) utilizzando il software IonTORRENT per identificare/validare le putative mutazioni identificate.
- Western Blotting (WB) e immunoistochimica (IHC): entrambe le metodiche saranno eseguite utilizzando anticorpi mono e poli-clonali sia contro la forme totali e/o fosforilate di vari marcatori utilizzati nel nostro laboratorio. Per analisi di IHC saranno utilizzati sistemi biotin-free di polimeri di destrano (eg EnVision, Dako) e si utilizzerà un sistema di rivelazione cromogenica (DAB, Dako)
- Estrazione RNA e retro trascrizione: i campioni tissutali saranno trattati secondo il protocollo di laboratorio: micro dissezione manuale, estrazione di RNA eseguita mediante trattamento in GITC/Sarcosine/DTT seguito da fenolo/cloroformio/isoamilalcol ed etanolo 75% per il lavaggio finale. Per le cellule sarà applicato il protocollo Qiazol (Qiagen). In entrambi i casi il materiale ribonucleico verrà diluito in acqua sterile e retrotrascritto in cDNA secondo metodica (Invitrogen)
- Real Time PCR: il cDNA ottenuto dalla retrotrascrizione sarà utilizzato per valutare i livelli di espressione genica dei geni in studio e delle molecole correlate. Verrà utilizzata la metodica TaqMan (Applied Biosystems) e/o SYBR green (Applied Biosystems) i valori di espressione genica saranno normalizzati sui livelli di espressione di geni di riferimento opportunamente selezionati. Un RNA totale commerciale (Stratagene) sarà utilizzato come calibratore. I valori numerici saranno elaborati con la metodica 2(-deltadeltaCt)
- Analisi Statistica: saranno eseguiti specifici test statistici per studiare le correlazioni tra i pattern mutazionali identificati e le variabili clinico-patologiche, la resistenza alla terapia e la sopravvivenza delle pazienti.


 

Descrizione della tipologia e indicazione del numero dei partecipanti al Progetto

Pazienti uomini e donne affetti da tumore del polmone NSCLC avanzato

Risultati 

in corso

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