I vincitori
Edizione 2015-2016
Rilevazione della malattia minima residua e identificazione di biomarcatori nel linfoma mantellare: valutazione prospettica dei pazienti arruolati nello studio clinico di fase III FIL- MCL0208
Responsabile del progetto:
Simone Ferrero
Ricercatore a tempo determinato di tipo B
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Ematologia 1U – Università di Torino
Altri ricercatori coinvolti:
Elisa Genuardi
Beatrice Alessandria
Martina Ferrante
Barbara Mantoan
Daniele Grimaldi
Elena Arrigoni
Gian Maria Zaccaria
Marco Ghislieri
Gabriele De Luca
Alice Di Rocco
Alessandro Re
Vittorio Stefoni
Federica Cavallo
Carola Boccomini
Monica Balzarotti
Vittorio Ruggero Zilioli
Filipa Moita
Luca Arcaini
Elisa Lucchini
Filippo Ballerini
Mariapia Pironti
Benedetta Puccini
Giuseppe A. Palumbo
Sara Galimberti
Sergio Cortellazzo
Antonello Di Paolo
Marco Ladetto
Il progetto
Durata prevista: 48 mesi
Sintesi del programma di ricerca
Il progetto di ricerca tratta del linfoma mantellare, un tumore del sangue non particolarmente frequente ma difficile da trattare, sia perché in parte resistente alla chemioterapia, sia perché i pazienti rispondono in maniera diversa alle terapie, cioè alcuni pazienti recidivano presto, poco dopo la terapia, e altri invece hanno lunghe risposte. Il progetto si propone di studiare con dei metodi biologici dei marcatori che possano predire l’andamento del paziente. Gli obiettivi di progetto riguardano l’esecuzione di studi biologici sui campioni di sangue di 300 pazienti con linfoma mantellare, arruolati in un protocollo della Fondazione Italiana Linfomi (FIL). I progetti sui campioni di questi pazienti sono diversi, alcuni riguardano degli studi di mutazione del DNA, altri di espressione genica, studi di farmacogenomica e studi di malattia minima residua.
Descrizione del progetto:
Premessa/Introduzione
Questo progetto nasce come proposta per una presa in carico globale della persona assistita con patologia neurooncologica. Le riflessioni alla base dell’iniziativa sono scaturite da degli incontri fra operatori in cui venivano condivise le domande relative agli aspetti della vita quotidiana (gestione della terapia, alimentazione, lavoro, attività di svago) che i pazienti ponevano con maggiore frequenza.
Obiettivi specifici
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Valutazione MRD nei pazienti affetti da mieloma Multiplo e arruolati nello studio clinico forte.
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Correlazione fra le metodiche.
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Correlazione con PFS e OS e tassi di risposta nei vari bracci di trattamento.
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Valutazione MRD sostenuta e conversione MRD durante mantenimento.
Descrizione del progetto:
Premessa/Introduzione
Il linfoma mantellare è una neoplasia aggressiva, rappresenta il 6-8% dei linfomi non-Hodgkin ed è caratterizzato dalla traslocazione t(11;14)(q13;q32) che determina l’iperespressione della ciclina D1. Nonostante i notevoli progressi terapeutici degli ultimi anni, il linfoma mantellare rimane una malattia difficile da gestire, caratterizzata da una prognosi sfavorevole nel medio-lungo periodo. La chemioterapia ad alti dosaggi, supportata dal trapianto autologo di cellule staminali (ASCT), è l'attuale standard di cura per i pazienti più giovani, generalmente con elevati tassi e lunghe durate di risposta clinica, ma alla fine si verifica quasi sempre una ricaduta e i pazienti di solito muoiono a causa della progressione della malattia.
Tuttavia, al giorno d'oggi il linfoma si è rivelata una malattia altamente eterogenea, con alcuni casi estremamente aggressivi e refrattari e altri caratterizzati da un esito migliore, con remissioni post-terapia stabili. Pertanto, vi è urgente bisogno di adattare la terapia alla presentazione pleomorfa della malattia. La possibilità di personalizzare il trattamento sulle caratteristiche specifiche di ciascun paziente è resa possibile dalla disponibilità di alcuni strumenti prognostici validati, come il MIPI (MCL international prognostic index) e l'indice proliferativo Ki-67, nonché di predittori precoci di risposta al trattamento, come l'analisi della malattia minima residua (MRD). L'analisi MRD mediante PCR con oligonucleotidi allele-specifici (ASO) è in grado di rilevare livelli molto bassi di cellule tumorali residue (fino a 1 cellula tumorale su 100.000 cellule sane) in pazienti che raggiungono una risposta clinica completa (CR) dopo il trattamento. Questo strumento, attualmente applicabile a circa il 90% dei pazienti con il linfoma mantellare, è un efficace predittore precoce di esito, mostrando un valore prognostico indipendente in grandi serie di pazienti e dimostrandosi un predittore migliore della CR in analisi multivariata. Inoltre, la valutazione prospettica MRD è in grado di identificare precocemente i pazienti con rischio crescente di recidiva imminente, individuando quei pazienti che mostrano una ricomparsa della MRD (per così dire, risultati nuovamente positivi) e quindi inclini a ricadute nel corso dei mesi o anni successivi: questi pazienti "ad alto rischio" potrebbero essere soggetti ideali per ricevere trattamenti preventivi, volti ad evitare una ricaduta massiva della malattia. Pertanto, nel prossimo futuro l'analisi MRD potrebbe essere utilizzata per stratificare i pazienti con il linfoma mantellare in diverse classi di rischio, ai quali offrire un trattamento personalizzato, come già accade in altri tumori ematologici, come la leucemia linfoblastica acuta. Il presente progetto si concentra dunque sull'analisi MRD mediante ASO-PCR quantitativa di campioni di midollo osseo (MO) e sangue periferico (SP) raccolti prospetticamente nel laboratorio di biologia molecolare dell’Ematologia Universitaria di Torino dai pazienti con linfoma mantellare arruolati nello studio clinico multicentrico, randomizzato, di Fase III “MCL0208”, sponsorizzato dalla Fondazione Italiana Linfomi, FIL (codice EudraCT: 2009-012807-25).
Obiettivi specifici
L'obiettivo generale del progetto è il monitoraggio quantitativo della malattia minima residua (MRD) su campioni MO e SP dei 300 pazienti arruolati nello studio. In particolare, la valutazione quantitativa MRD di campioni prospettici è in grado di descrivere con precisione la cinetica della clearance tumorale per ciascun paziente in ogni momento durante il programma terapeutico pianificato.
Inoltre, l'obiettivo secondario del progetto è la costituzione di una biobanca completa di casi di linfoma mantellare, impegnata a eseguire gli studi biologici ausiliari già descritti.
Gli obiettivi principali del presente progetto sono:
1) Valutare l'efficacia di diversi blocchi di trattamento (induzione R-CHOP, alte dosi di citarabina e consolidamento ASCT) in termini di restringimento della MRD e raggiungimento di risposte molecolari profonde;
2) Valutare l'efficacia del mantenimento di lenalidomide (rispetto all'osservazione) in termini di prolungamento delle risposte molecolari ottenute dopo ASCT e in termini di raggiungimento di ulteriori risposte molecolari;
3) Valutare l'impatto prognostico del raggiungimento della risposta molecolare, in termini di tasso di recidiva, sopravvivenza libera da progressione (PFS) e sopravvivenza globale (OS);
4) Valutare l’impatto del monitoraggio prospettico della cinetica MRD durante le diverse fasi del trattamento e durante il successivo follow-up, per l'identificazione precoce di pazienti a più alto rischio di recidiva;
5) Raccogliere regolarmente e conservare i campioni biologici sia alla diagnosi che in seguito alla terapia, per poi distribuirli a diversi laboratori per la conduzione degli altri studi ancillari, quali:
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Identificazione di biomarcatori predittivi del fallimento della chemioterapia intensiva mediante le metodiche di target resequencing e DNA profiling su campioni di cellule tumorali purificate (Università di Novara, Italia);
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Analisi di farmacogenetica con l’obiettivo di individuare, mediante la metodica allele-specific RT-PCR, i polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) dei geni codificanti per trasportatori di membrana, enzimi metabolici e recettori della superficie cellulare potenzialmente in grado di predire l’efficacia terapeutica (Università di Pisa, Italia).
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Profilo di espressione genica di cellule tumorali SP (CRO Aviano, PN, Italia)
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Profilazione pan-genomica del DNA di cellule tumorali MO (IOR/IOSI Bellinzona, CH)
Descrizione della metodologia (ed eventuali materiali)
Le cellule tumorali sono state estratte dai campioni di MO basale e immagazzinate come pellet secco. Inoltre, il materiale germinale è stato derivato e immagazzinato da campioni di SP. Il DNA dei campioni dei pazienti sarà estratto da DNAzol (Invitrogen), in conformità con le istruzioni del produttore. I campioni basali sono già stati sottoposti a screening per un marcatore molecolare basato sulla traslocazione Bcl-1/IGH o sul riarrangiamento specifico dei pazienti IGH: Bcl-1/IGH mediante l'approccio PCR semi-nidificato; il riarrangiamento IGH mediante sequenziamento Sanger utilizzando primer di senso del consenso derivati dalla regione leader (L) e dalla prima regione quadro (FR1) e un primer antisenso di consenso derivato dall'FR4.
L'analisi MRD mediante PCR nidificata qualitativa è già in corso secondo l'approccio pubblicato, utilizzando primer di consenso per il marcatore Bcl-1 / IGH e gli oligonucleotidi alle-specifici (ASO) -primer (mirati alle regioni CDR2 e CDR3) per il riarrangiamento IGH. [L'analisi quantitativa MRD sarà eseguita su tutti i campioni raccolti su entrambi i marcatori molecolari sia mediante RQ-PCR standardizzata, secondo le linee guida EuroMRD o mediante PCR digitale a goccioline (ddPCR) seguendo l'approccio pubblicato per i casi non valutabili mediante RQ-PCR (bassa infiltrazione tumorale del campione basale o curva standard inaffidabile). In entrambi i metodi le reazioni saranno eseguite con gli stessi primer ASO utilizzati nella PCR nidificata e una sonda di consenso derivata dalla regione FR3, come precedentemente riportato.
Le curve standard saranno preparate mediante diluizioni seriali 10 volte, a partire da 500 ng, ottenute dal tessuto diagnostico diluito in DNA policlonale derivato da quantità equivalenti di 5 donatori sani. Il gene RNasi P sarà utilizzato come gene standard di riferimento per la qualità e la normalizzazione del DNA. I dati RQ-PCR saranno generati e analizzati secondo le linee guida Euro MRD
Infine, i risultati quantitativi MRD generati saranno correlati con i dati clinici e l'esito dei pazienti forniti dal centro clinico FIL.
L’analisi mutazionale delle cellule tumorali è stata effettuata mediante NGS, utilizzando un pannello con gli esoni codificanti e i siti di splicing di 7 geni (ATM, TP53, CCND1, WHSC1, KMT2D, NOTCH1 exon 34, BIRC3). Nel pannello inoltre sono stati inclusi anche TRAF2 e CXCR4.
Le librerie NGS sono state preparate utilizzando il TruSeq Custom Amplicon sequencing assay, in conformità con le istruzioni del produttore (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).
Per le analisi dello studio di farmacogenetica, invece, il genotipo dei pazienti è stato ottenuto mediante la tecnologia di RT-PCR TaqMan SNP Genotyping Assays (ABI, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Per attribuire il genotipo dei pazienti è stato utilizzato il software SDS (Applied Biosystems), sono state calcolate poi la frequenza degli alleli e dei genotipi ed è stato elaborato il modello di Hardy-Weinberg. Infine, i diversi aplotipi e le loro frequenze sono state imputate utilizzando il software Arlequin.
Descrizione della tipologia e indicazione del numero dei partecipanti al Progetto
Pazienti con linfoma mantellare arruolati nello studio clinico multicentrico, randomizzato, di Fase III MCL0208, sponsorizzato dalla Fondazione Italiana Linfomi, FIL (codice EudraCT: 2009-012807-25).
Lo studio ha coinvolto 300 giovani (< 65 anni), in stadio avanzato. Il programma terapeutico comprende una fase di induzione chemio-immunoterapica ("R-CHOP"), seguita da un trattamento con citarabina ad alte dosi, raccolta di cellule staminali del sangue periferico (PBSC) ("leucaferesi") e ASCT.
Infine, i pazienti che rispondono sono randomizzati tra il mantenimento con lenalidomide per 24 mesi o l'osservazione.
Risultati
Questo progetto genererà una grande quantità di dati biologici, sia da MRD che da studi ausiliari, su un'ampia serie di pazienti prospettici, completamente annotati, con linfoma mantellare arruolati in uno studio clinico di fase III. I dati MRD non solo descriveranno l'efficacia dei diversi trattamenti proposti (immunochemioterapia, ASCT, lenalidomide) nell'eliminare la malattia residua, ma aggiungeranno anche informazioni prognostiche molto preziose, identificando subito dopo la fine del trattamento i "pazienti ad alto rischio", cioè quei pazienti più inclini a una recidiva precoce. Tale stratificazione del paziente è altamente predittiva e potrebbe guidare la concezione di futuri studi clinici che offrono trattamenti diversi a pazienti a diverso rischio di recidiva (terapia "su misura" o "personalizzata").
Inoltre, gli studi accessori previsti sulle cellule tumorali (resi possibili dall'efficiente raccolta di campioni garantita dal monitoraggio MRD) hanno aggiunto approfondimenti biologici sul linfoma mantellare:
la mutazione di KMT2D rappresenta un biomarcatore genetico nuovo ed indipendente che si associa negativamente sia all’OS che al PFS; sia la mutazione che la delezione di TP53 hanno un valore prognostico negativo nei giovani pazienti con MCL sottoposti ad alte dosi di chemio-immunoterapia seguita da ASCT, sia in termini di OS che PFS; l’identificazione della mutazione di KMT2D o l’aberrazione di TP53 (o entrambi) definisce un gruppo di pazienti giovani con MCL ad alto rischio con un outcome non ancora soddisfacente, nonostante l’immunochemioterapia intensiva e l’ASCT. Questi dati quindi stabiliscono nuovi biomarcatori predittivi in grado di stratificare i pazienti in diverse classi di rischio in grado di offrire trattamenti personalizzati, basati sull'effettivo rischio di refrattarietà alle terapie standard.
Infine, dalle analisi di farmacogenomica è emerso che: i pazienti con genotipo polimorfico per ABCB1, NCF4 e GSTP1 presentano un vantaggio in termini di sopravvivenza rispetto ai pazienti con genotipo omozigote wild-type; il genotipo polimorfico per NCF4, inoltre, si associa ad un aumentato rischio di sviluppare tossicità infettive, a differenza del genotipo polimorfico di FCGR2A che è risultato essere associato ad una riduzione del rischio di insorgenza delle tossicità infettive. Inoltre, i pazienti con genotipo omozigote polimorfico per CRBN presentano un rischio più elevato di ridurre la dose di lenalidomide, o addirittura di interrompere il trattamento. Questi risultati hanno dimostrato quindi che attraverso analisi farmacogenetiche è possibile individuare nel MCL biomarcatori potenzialmente predittivi di risposta al mantenimento con lenalidomide post-ASCT e di rischio più elevato di sviluppare tossicità ematologiche e infettive durante la fase di chemio-immunoterapia.
Conclusioni
Le pubblicazioni sul progetto al momento sono sei e riguardano:
1) l’identificazione di mutazioni che conferiscono una prognosi negativa al paziente (Ferrero S et al., Haematologica 2020);
2) lo studio del profilo di espressione genica del tumore, in grado di identificare un gruppo di pazienti ad alto rischio (Bomben R et al., Haematologica 2018);
3) lo studio di nuove metodologie per l’analisi di malattia minima residua (Genuardi E et al., Hematol Oncol 2021; Genuardi et al., BJH 2021; Ferrero S et al, Blood 2022);
4) l’utilizzo di strumenti informatici automatizzati per la raccolta e conservazione dei dati clinici e biologici del protocollo, propedeutici all’analisi congiunta degli stessi (Zaccaria GM et al., JCO-CCI 2019);
Inoltre, gli altri studi ancillari sono stati già presentati a congressi scientifici internazionali o sottomessi a riviste scientifiche per la pubblicazione sui seguenti temi: applicazione di strumenti di intelligenza artificiale per lo sviluppo di nuovi modelli predittivi del rischio (Zaccaria GM et al., ASH 2018), studio di polimorfismi del DNA che possono predire la risposta al trattamento con lenalidomide (Ferrero S et al., ASH 2020), studio delle aberrazioni cromosomiche per l’identificazione dei pazienti ad alto rischio (Ferrero S et al., ICML 2021)