I vincitori

Edizione 2018-2019

MicroRNAs nelle urine come biomarcatori per la diagnosi
e il monitoraggio del tumore alla vescica non invasivo ad alto rischio: verso un test non-invasivo

Responsabile del progetto:

Barbara Pardini
Principale ricercatore
-
Italian Institute for Genomic Medicine (IIGM)


Altri ricercatori coinvolti:

Giuseppe Matullo
Collaboratore, referente biobanca

Dip. Di Scienze mediche, Univ. Di Torino


Alessandra Allione
Collaboratrice, referente ed organizzatrice della biobanca

Dip. Di Scienze mediche, Univ. Di Torino


Marco Allasia
Collaboratore, responsabile reclutamento campioni


Dip. di Urologia, A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino

Marco Oderda
Collaboratore, responsabile reclutamento campioni

Dip. di Urologia, A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino

Il progetto

Durata prevista: 18 mesi
Sintesi del programma di ricerca
Il tumore della vescica è il quinto tipo di cancro più comune nella popolazione generale e la sua incidenza aumenta con l'età, che rappresenta quindi uno dei fattori di rischio più significativi per questa malattia. Gli uomini sono maggiormente colpiti, con un rapporto uomo/donna di 3:1 nell’incidenza di questa malattia. Un'ampia gamma di fattori di rischio ambientale sono stati associati a questa malattia, tra questi il fumo di tabacco, il consumo di acqua contaminata dall'arsenico, l'esposizione professionale ad ammine aromatiche ed idrocarburi policiclici e l'infezione cronica da specie Schistosoma. Diverse varianti germinali possono contribuire ad una predisposizione genetica per questo tipo di tumore.
In Europa, ogni anno sono stimati circa 175.000 nuovi casi di tumore alla vescica con 52.000 decessi (5.600 solo in Italia). Negli ultimi anni la speranza di vita è migliorata: la sopravvivenza a cinque anni dei casi infatti supera, nel nostro Paese, l'80 per cento. Nonostante questi numeri, da anni le associazioni dei pazienti denunciano una sottovalutazione della malattia. I finanziamenti per la ricerca medico-scientifica contro questa neoplasia non rispecchiano né la diffusione né la sua complessità clinica. Al momento non sono disponibili nuovi studi clinici che riescano ad effettuare diagnosi precoci soprattutto per individuare le persone considerate ad alto rischio di sviluppare la malattia.
Per il tumore della vescica non esistono segni o sintomi specifici che ne consentano una diagnosi precoce. L’ematuria (i.e. la presenza di sangue nelle urine) è un segnale molto frequente nei pazienti con questo tipo di tumore, ma spesso si tratta di un fenomeno comune anche alle più frequenti infezioni urinarie e ne presenta, per la gran parte, sintomi uguali. Il persistere o ripetersi di questo sintomo, in particolare se in persone a rischio (fumatori, esposizioni professionali) o con storia familiare positiva per tumore della vescica, induce il medico alla richiesta di esami come la cistoscopia di controllo associata ad una citologia urinaria.
I pazienti con tumore della vescica non muscolo-invasivo (non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC) rappresentano una classe altamente eterogenea caratterizzata da un variabile rischio di ricorrenza dopo la resezione chirurgica (31-78%) e un alto tasso di progressione (1-45%). I pazienti NMIBC ad alto rischio (HRNMIBC) sono quelli per cui la scelta dell`approccio per il trattamento e la terapia risulta più complicata.
Il monitoraggio di biomarcatori molecolari è particolarmente importante nel caso di patologie tumorali per cui sono attuabili programmi di screening della popolazione, i quali permettono di aumentare l'individuazione precoce della malattia e di migliorare le misure di prevenzione. Una strategia di screening per il tumore della vescica potrebbe implementare la sua diagnosi precoce per migliorare la sopravvivenza dei pazienti e ridurre le frequenti e dolorose biopsie a cui i pazienti affetti sono sottoposti. Attualmente, la citologia delle urine è il test non invasivo più comunemente usato per la rilevazione di tumori della vescica, ma presenta un valore limitato a causa della sua scarsa sensibilità, soprattutto per le lesioni di basso grado. La biopsia guidata da cistoscopia per la valutazione istologica può offrire un'elevata accuratezza diagnostica, ma è invasiva e scomoda per i pazienti, e ciò ne limita l'uso generale per lo screening di questo tipo di cancro.
Il tumore della vescica è tra i tumori più costosi per il sistema sanitario e pone una sfida economica significativa perché l'alto tasso di recidive richiede una sorveglianza cistoscopica continua. C’è quindi un bisogno concreto di sviluppare nuovi biomarcatori molecolari non invasivi e sensibili per migliorare le attuali strategie per il rilevamento e monitoraggio di pazienti affetti da tumore della vescica, in generale, ed individui ad alto rischio (HRNMIBC), in particolare, che sono molto più difficili da individuare e trattare.
L’analisi di dati genetici ed epigenetici, come porzioni genomiche oppure di trascritti codificanti e non, è sempre più frequente in ambito clinico, sia per l’identificazione dell’insorgenza di una patologia tumorale sia per il monitoraggio della stessa nel tempo. Di conseguenza, l’identificazione di biomarcatori molecolari efficaci ed efficienti è fondamentale ed avviene principalmente attraverso lo studio dei cambiamenti genetici ed epigenetici caratterizzanti il tumore in esame. In particolare, la ricerca si sta focalizzando sull’analisi di campioni biologici facilmente reperibili, quali ad esempio plasma, urine o feci, che consente di misurare i biomarcatori tumorali in maniera non invasiva per i pazienti, ripetutamente nel tempo, a bassi costi, e con una elevata sensibilità. Il monitoraggio di biomarcatori molecolari è particolarmente importante nel caso di patologie tumorali perché può permettere l’attuazione di programmi di screening della popolazione per aumentare le capacità di individuazione precoce della malattia e di migliorare le misure di prevenzione, riducendo inutili e dolorose biopsie per il paziente ed abbassando i costi di gestione dei pazienti affetti.
Lo scopo del presente progetto è l`identificazione di nuovi biomarcatori molecolari nelle urine in grado di discriminare i soggetti con lesioni alla vescica in stadi più precoci e capaci anche di caratterizzare in maniera altamente specifica i sottogruppi più a rischio di recidiva e progressione della malattia (per esempio i pazienti HRNMIBC). Studieremo quindi i profili urinari di microRNA ed altri small non-coding RNA in pazienti NMIBC e controlli sani per identificare firme molecolari associate alla malattia e ai vari sottotipi clinicopatologici con particolare attenzione all’individuazione dei soggetti HRNMIBC.

 

Descrizione del progetto:

Premessa/Introduzione

 Questo progetto nasce come proposta per una presa in carico globale della persona assistita con patologia neurooncologica. Le riflessioni alla base dell’iniziativa sono scaturite da degli incontri fra operatori in cui venivano condivise le domande relative agli aspetti della vita quotidiana (gestione della terapia, alimentazione, lavoro, attività di svago) che i pazienti ponevano con maggiore frequenza.

 

Obiettivi specifici

  • Valutazione MRD nei pazienti affetti da mieloma Multiplo e arruolati nello studio clinico forte. 

  • Correlazione fra le metodiche.

  • Correlazione con PFS e OS e tassi di risposta nei vari bracci di trattamento.

  • Valutazione MRD sostenuta e conversione MRD durante mantenimento.


 

Descrizione del progetto:

Premessa/Introduzione

 Negli ultimi anni la ricerca scientifica nell’ambito del tumore della vescica si è orientata verso un miglioramento della prevenzione mirato all’identificazione di nuovi biomarcatori molecolari in grado di discriminare i soggetti con lesioni a stadi più precoci e caratterizzando in maniera altamente specifica i sottogruppi più a rischio di recidiva e progressione della malattia (per esempio i pazienti HRNMIBC). Questa ricerca si è focalizzata sui cosiddetti “tessuti surrogati” (come sangue ed urine) che possono essere raccolti senza particolari fastidi e pericoli per il paziente e ripetutamente nel tempo. Evidenze in letteratura hanno mostrato che alcune specifiche alterazioni genetiche/epigenetiche sembrano essere dei candidati ideali sia per la diagnosi che per la prognosi (Pardini et al. microRNA profiles in urine by next-generation sequencing can stratify bladder cancer subtypes. Oncotarget. 2018 Apr 17;9(29):20658-20669. doi: 10.18632/oncotarget.25057 e Sabo et al. Small Non-Coding RNA Profiling in Plasma Extracellular Vesicles of Bladder Cancer Patients by Next-Generation Sequencing: Expression Levels of miR-126-3p and piR-5936 Increase with Higher Histologic Grades. Cancers. 2020 Jun 9;12(6):1507. doi: 10.3390/cancers12061507).
Gli small non-coding RNA (sncRNA) sono piccole molecole di RNA non codificante, le cui funzioni comprendono il controllo trascrizionale, le modificazioni cromatiniche nel nucleo e la regolazione della traduzione nel citoplasma. Tra le varie peculiarità attribuite a queste molecole c’è il loro potenziale ruolo nel rilevare l’insorgenza di tumori, incluso il cancro della vescica. Gli sncRNA sono presenti in tutti i tessuti e sono stati rilevati anche in tessuti surrogati. Al momento sono stati ottenuti dei risultati molto promettenti per un insieme di microRNA (miRNA, una delle classi di sncRNA tra le più studiate) capaci di discriminare individui sani da quelli con tumore della vescica e di poter distinguere le principali sottoclassi del tumore (muscolo invasivo e non muscolo invasivo), mediante analisi nelle urine dei pazienti (Pardini et al. microRNA profiles in urine by next-generation sequencing can stratify bladder cancer subtypes. Oncotarget. 2018 Apr 17;9(29):20658-20669. doi: 10.18632/oncotarget.25057). Ad oggi non è stato ancora identificato un insieme di sncRNA, che consenta una stratificazione dei pazienti in modo accurato ed una precisa individuazione dei soggetti più difficili da trattare come gli HRNMIBC. Per questi casi, infatti, la cistoscopia ripetuta nel tempo (a distanza di pochi mesi e ripetutamente per diversi anni) rimane ancora l’unico strumento di diagnosi accurata per questo tipo di tumore.

Obiettivi specifici

Obiettivo primario è creare un nuovo protocollo diagnostico/prognostico (Uro-smallRNA) per i casi NMIBC basato sull’analisi dei livelli di espressione di microRNA (miRNA) ed altri small non-coding RNA (sncRNA) mediante tecnologia di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Uro-smallRNA permetterebbe di stratificare in maniera più accurata i pazienti con tumore della vescica e di selezionare più precocemente quelli ad alto rischio con maggiore probabilità di progressione/ricorrenza (HRNMIBC). Studieremo i profili urinari di miRNA ed altri sncRNA in pazienti NMIBC e controlli sani per identificare firme molecolari associate alla malattia e ai vari sottotipi clinicopatologici con particolare attenzione all’individuazione dei soggetti HRNMIBC.

 

Descrizione della metodologia (ed eventuali materiali)

Il progetto si articola in due fasi: (i) definizione di una firma molecolare di miRNA ed altri sncRNA (pannello Uro-smallRNA) mediante sequenziamento di nuova generazione su una estesa casistica di campioni di urina di pazienti e di controlli; (ii) validazione delle firme molecolari ottenute su pazienti sia in una popolazione indipendente che sugli stessi pazienti impiegati nella prima fase e seguiti nel tempo con valutazione delle potenzialità prognostiche delle firme ottenute per i casi a più alto rischio.
Durante la prima fase del progetto verranno analizzati i profili di miRNA e di altri sncRNA in una coorte di casi con tumore della vescica e di controlli che andrà ad ampliare la coorte che è già stata analizzata dalla proponente del progetto. Questo per avere un numero maggiore di casi e soprattutto per includere un numero sufficiente di sottogruppi a maggiore rischio di progressione (gruppo che mancava nella prima serie analizzata).
La seconda fase del progetto sarà dedicata alla verifica dei risultati sperimentali mediante tecniche di digital-PCR in una popolazione indipendente, usando fondi di ricerca derivati da iniziative di collaborazione attualmente attive. Inoltre i casi analizzati nella prima fase saranno seguiti nel tempo per verificare che le firme molecolari individuate possano funzionare anche da fattori prognostici e predittivi della malattia.
 

 

Descrizione della tipologia e indicazione del numero dei partecipanti al Progetto 

La raccolta dei campioni è iniziata già da molto tempo e i soggetti coinvolti fanno parte dei pazienti reclutati presso il dipartimento di Urologia dell`A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino ed inseriti nel progetto Turin Bladder Cancer Study (TBCS) (Sacerdote et al. Polymorphisms in the XRCC1 gene modify survival of bladder cancer patients treated with chemotherapy. 2013 International journal of cancer, 133, 2004-9; Pardini et al. Increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of bladder cancer. British journal of cancer, 2017, 116, 202-210).
La popolazione dello studio include uomini e donne, di età compresa tra 40 e 75 anni, residenti o domiciliati in Piemonte ed arruolati alla diagnosi di tumore della vescica. Parallelamente sono stati reclutati anche i controlli tra i pazienti trattati negli stessi reparti di urologia per malattie non neoplastiche o tra i pazienti trattati presso reparti medici e chirurgici per vari problemi (ernie, vasculopatie, diabete, insufficienza cardiaca, asma o altre malattie benigne). I casi e i controlli hanno fornito i campioni di materiale biologico (urine) e riempito un questionario validato sulle abitudini alimentari e sullo stile di vita. La bio banca creata conta ad oggi i campioni di urina di circa 290 casi e 260 controlli.
Il progetto risponde ad una necessità nata sul territorio piemontese di creare una forte sinergia tra le analisi epidemiologiche e le analisi di dati di sequenziamento massivo, fornendo ai medici urologi che collaborano con la proponente degli strumenti molecolari per il miglioramento delle diagnosi e un più efficace monitoraggio di pazienti con tumore della vescica. Tutto ciò con il fine ultimo di ridurre i costi del sistema sanitario per il monitoraggio dei pazienti NMIBC e soprattutto di ridurre i disagi fisici e psicologici dei malati, legati a ripetute biopsie per il monitoraggio dell’avanzamento della malattia.
Oltre all’Università di Torino, al progetto partecipa un` Azienda Ospedaliera Piemontese che costituisce uno dei principali centri di riferimento italiano per il trattamento dei tumori della vescica con oltre 500 casi trattati all'anno.

 

Risultati

Ad oggi sono stati effettuati esperimenti per valutare l’espressione di sncRNA presenti nei campioni di urine di 116 soggetti attraverso la tecnologia NGS. Tali esperimenti sono stati svolti dal proponente del progetto.
I dati generati sono stati analizzati computazionalmente e statisticamente tramite pipeline di analisi specifiche sviluppate dal gruppo della Dott.ssa Cordero. I dati preliminari generati hanno portato all’ottenimento di firme molecolari specifiche di miRNA in grado di distinguere i pazienti con tumore muscolo invasivo e tumore non muscolo invasivo dai controlli sani. Per i medici urologi è però necessaria una maggiore precisione di diagnosi che è lo scopo del presente progetto.
Lo studio si avvale già di dati che sono stati pubblicati negli ultimi anni (Pardini et al. microRNA profiles in urine by next-generation sequencing can stratify bladder cancer subtypes. Oncotarget. 2018 Apr 17;9(29):20658-20669;) in cui sono state individuate firme molecolari di miRNA nelle urine in grado di distinguere i maggiori sottotipi di tumore della vescica. Dallo studio è stato anche generato un brevetto (Notifica domanda di brevetto italiana n. 102017000138247 registrata in data 30 Nov 2017; “UromiRNA per la diagnosi in vitro di tumore della vescica”).
I dati al momento disponibili permettono la distinzione dei casi affetti da tumore della vescica e dei suoi macrogruppi istologici (tumore muscolo-invasivo, MIBC, e non-muscolo invasivo di diverso grado, NMIBC), confermando il valore diagnostico del test.
In un altro lavoro pubblicato dal nostro gruppo (Allione A, Pardini B, et al. MMP23B expression and protein levels in blood and urine are associated with bladder cancer. Carcinogenesis. 2018 Oct 8;39(10):1254-1263) abbiamo valutato i livelli di espressione genica e proteica di MMP23 nel sangue, nel plasma e nelle urine di pazienti con tumore della vescica e controlli sani provenienti dalla stessa coorte di campioni raccolti a Torino. In particolare, l` espressione del gene MMP23B e del suo pseudogene MMP23A era significativamente più bassa nel sangue dei pazienti con tumore della vescica quando confrontati coi controlli sani. Al contrario, i livelli di proteina MMP23B nel plasma e nelle urine degli stessi pazienti erano più alti nei casi tumorali che nei controlli. Il dosaggio della proteina MMP23B nelle urine era correlato al grado e al rischio di tumore alla vescica dando quindi indicazioni sulla prognosi dei pazienti.
Recentemente abbiamo pubblicato un lavoro (Sabo AA, et al. Small Non-Coding RNA Profiling in Plasma Extracellular Vesicles of Bladder Cancer Patients by Next-Generation Sequencing: Expression Levels of miR-126-3p and piR-5936 Increase with Higher Histologic Grades. Cancers (Basel). 2020 Jun 9;12(6):1507; Figura 1)

Figura 1. Panoramica schematica dell'approccio sperimentale e principali risultati ottenuti.

 

In particolare, i livelli di espressione dei miRNA e di altri piccoli RNA non codificanti (sncRNAs) sono stati misurati nelle vescicole extracellulari (EVs) contenute nel plasma di pazienti con tumore alla vescica e controlli sani (47 uomini con tumore della vescica e 46 controlli sani). I principali risultati sono riportati in Figura 2. I profili degli sncRNA sono stati comparati anche con quelli delle stesse specie misurati nelle urine degli stessi individui. Il miR-4508 è risultato sottoespresso nelle EVs da plasma dei pazienti con tumore muscolo invasivo (Figura 2A). Una simile associazione è stata osservata anche per miR-454-5p e miR-628-3p (Figura 2A). Nel plasma e nelle urine dei pazienti tumorali con grado 3, il miR-126-3p era sovraespresso quando paragonato coi controlli (Figura 2B).
Stratificando i casi secondo la classificazione istologica più recente dell'OMS 2004, l'unico sncRNA significativamente alterato è risultato miR-450b-5p, i cui livelli di espressione tendevano ad essere bassi nei casi con tumore di basso grado (Figura 2C). Due sncRNA sono risultati associati con l` andamento della classe di rischio: il miR-4508 tendeva a scendere nei livelli di espressione passando dai controlli sani ai pazienti con tumore alla vescica di alto grado (Figura 2D), mentre il piR-hsa-5936 tendeva a crescere nello stesso confronto. Inoltre, i casi di tumore alla vescica con bassa espressione di miR-185-5p e di miR-106a-5p oppure con alta espressione di miR-10b-5p mostravano di avere una più breve sopravvivenza. Ancora una volta, gli sncRNAs sia misurati nelle EVs del plasma che nelle urine possono essere tenuti in considerazione come potenziali marcatori diagnostici per il tumore alla vescica, soprattutto per quanto riguarda gli stadi avanzati della malattia.

Figura 2. Conte normalizzate degli sncRNA differentemente espressi nei vari confronti in base alla diversa stratificazione della popolazione in studio: (A) diagnosi di cancro della vescica (BC) (MIBC = cancro della vescica muscolo invasivo; NMIBC = cancro della vescica non muscolo invasivo e controlli); (B) grado istologico WHO 1973 (G3, G1+G2 e controlli); (C) grado istologico WHO 2004 (HG=alto grado, LG=basso grado e controlli); e (D) classe di rischio (0 = controlli, 1 = rischio basso, 2 = rischio intermedio, 3 = rischio alto, 4 = MIBC).

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